글: 김민정 한의사 (김민정 한의원장)

암 세포 샘플 채취
암세포에서 발견되는 유전자 돌연변이는 생식세포 돌연변이(germline mutation: 부모로부터 전달된 유전자 돌연변이-전신세포에 있음) 과 체세포 돌연변이(somatic mutation: 살면서 생긴 돌연변이-개체특이적임) 로 나누어 집니다. 암환자에게서 암유전자 돌연변이를 찾아내기 위해 암 샘플을 채취하는데 이것은 생검을 하거나 수술을 통해 이루어집니다. 채취한 샘플은 병리학자들에게 보내져서 샘플의 유용한 정도(제대로 채취했는지) 확인 후 유전자 배열순서 규명작업을 합니다. 하지만 암조직 자체가 여러다른 돌연변이를 가지고 있는 단일하지 않은 조직이기 때문에 여러 가지 샘플을 비교함으로서 암을 일으키는 돌연변이를 찾아냅니다. 같은 암 조직내에 다른 샘플을 채취해 비교하거나 전이가 된 암이라면 전이된 부분의 샘플을 채취해서 두 조직의 샘플을 비교합니다. 암은 계속 진화하기 때문에 (돌연변이가 계속됨) 한 환자에게서 채취한 다른 조직의 암은 다른 유전자 돌연변이를 갖습니다.

암을 일으키는 유전자 돌연변이가 부모로부터 유전된 것인지(태어나면서부터 갖고 태어난 것인지) 확인하기 위해서 암 샘플을 정상 샘플(같은 환자의 정상세포)와 비교를 통해 확인할수 있습니다. 생식세포 돌연변이라면(germline mutation) 정상세포에서도 암세포와 동일한 유전자 돌연변이를 가지고 있습니다.암세포의 유전자 돌연변이를 찾아내기 위해서 비교할 수 있는 다른 샘플은 혈액샘플(cell-free DNA sample)입니다. 세포가 죽고 분해되면서 그 세포의 유전자는 분해되어 혈액 내에 떠다니게 됩니다. 따라서 혈액 샘플 내에서 우리 몸에 발견되는 모든 돌연변이 유전자를 발견할 수 있습니다. 생식세포 돌연변이와 체세포 돌연변이를 모두 발견할 수 있습니다. 혈액샘플을 가지고 암을 발견하는 것은 아직은 많은 연구가 필요합니다. 하지만 항암제에 내성에 영향을 주는 유전자 돌연변이를 발견한다던지 암이 재발했는지 여부를 확인하는 것에는 유용하게 쓰일 수 있습니다.

DNA sequencing library
암을 일으키는 변화는 RNA를 통해서 후성유전을 통해서도 확인할 수 있지만 가장 많이 이용되는 것은 DNA 염기서열의 변화를 통해 유전자 돌연변이를 찾아내는 것입니다. 세포에서 DNA를 뽑아낸 다음 관심이 있는 유전자(암 연관 유전자)를 검사하는 방식이 과거에 많이 이용되어 왔습니다.

1) whole genome sequencing
유전자 염기서열 규명하는 기술이 발달함에 따라 많은 유전자를 한 번에 검사할 수 있게 되었습니다. DNA를 작은 조각으로 분해하여 모아놓고 (sequencing library) 각 조각의 끝에 염기서열 규명을 할 수 있도록 어뎁터 sequencing을 부착 합니다. 이 과정이 끝나면 whole genome sequencing을 할 수 있습니다. 전체 유전자를 검사하는 이런 방식은 암을 일으키는 새로운 유전자 돌연변이 발견을 위해 사용됩니다.

2)whole exome sequencing
좀 더 효율적으로 암세포를 일으키는 유전자 돌연변이를 특정해서 살펴보기 위해서 DNA capture라는 방식을 사용하기도 합니다. DNA 염기서열은 G-C, A-T 이런 식으로 결합하는데 이 결합을 이용해서 암에 관련되어 찾고자하는 유전자 염기서열을 확인할 수 있습니다. 확인하고자 하는 유전자 돌연변이 부분에 상호 결합하는 유전자부분(probe)을 미리 넣어놓고 준비된 유전자조각들(DNA library)를 결합시킵니다. 유전자 조각들은 이중결합되어 있는 상태이기 때문에 열을 가해서 단일 조각으로 만든 후 probe와 결합시킵니다. probe 끝에는 자석같은 것이 붙어 있습니다. 확인하고 싶은 유전자 조각들이 해당 probe에 결합하면 나머지 유전자 조각들은 제거한 후 암에 연관된 유전자 돌연변이를 확인합니다. 전자기 특성을 이용해서 probe만 따로 한 곳에 모으고 나머지 부분을 버리는 방식으로 합니다. 이런 방식을 whole exome sequencing이라고 하고 원하는 유전자 부분의 돌연변이를 확인할 수 있는 sequencing library를 만들 수 있습니다.

염기서열 분석
유전자를 조각내어 준비한 sequencing library를 이용해 어떻게 유전자 돌연변이를 찾아내는지 살펴보겠습니다. 우선 sequencing library에 있는 유전자 염기서열을 다량으로 규명합니다. 규명된 염기서열의 가치에 대한 분석을 하고 제대로 되었다고 판단되면 규명된 염기서열을 reference sequence(건강한 사람 유전자)와 비교합니다. 현재 사용되는 reference sequence는 한 사람 것을 쓰는 것이 아니라 인종적 다양성 등을 고려한 것을 사용합니다. sequencing library의 유전자 조각들은 reference sequence와 비교하여 mean coverage를 찾아냅니다. 전체 유전자 염기서열이 아니라 일부 유전자 염기서열을 특정해서 비교하면 mean coverage가 높아지고 유전자 돌연변이를 찾아내는 것이 더 용이해 집니다. 이 과정을 통해서 찾아낸 유전자 돌연변이는 몇가지로 구분할 수 있습니다.

1) SNVs 단일 염기 돌연변이
sequencing library를 reference sequence와 비교했을 때 단일 염기 돌연변이가 있는 것이 확인된다면 DNA상 같은 부분의 여러 유전자를 나열하여 변형체 대립유전자 빈도(Variant Allele Frequency: VAF)를 확인할 수 있습니다. 암 샘플의 순도와 세포의 대립유전자 (동형인지 이형인지)에 따라 VAF는 달라지므로 이것을 통해 암에 대한 다른 정보를 얻을 수 있습니다. 단일 염기가 빠졌는지 덧붙여 졌는지 등도 확인 할 수 있습니다.

2) CNVs 단일 염기가 아닌 유전자의 일정 부분의 반복 copy number variants
sequencing library를 reference sequence와 비교했을 때 특정부분이 더 많이 반복되어 나타났을 때 CNVs를 확인 할 수 있습니다. 혹은 특정부분이 빠져있는 것을 확인 할 수 있습니다. DNA의 그 부분이 증가 되어있거나 빠져있는 것을 나타내는 것입니다.

3) 유전자 재배열-inversion, translocation
원래는 떨어져 있는 유전자 부분이 연결이 되어 fusion형태가 되었다면 sequencing library를 reference sequence와 비교했을 때 DNA조각 잘려진 조각 중 일부가 두 유전자를 다 포함하는 부분이 나타납니다.(두 유전자는 각각 떨어져서 나타나는 게 정상임)

<참고>
변형체 대립유전자 빈도(Variant Allele Frequency: VAF)
체성 돌연변이인지 생식세포 돌연변이인지 확인하는 방법은 정상조직과 암샘플을 비교하는 것입니다. 생식세포 돌연변이는 정상과 암 조직 두 군데서 발견이 되고 체성 돌연변이는 암에서만 발견되기 때문입니다. 그러나 이 방식은 가격이 많이 들고 실용성이 떨어지기 때문에 변형체 대립유전자 빈도(Variant Allele Frequency: VAF)를 이용하여 체성인지 생식세포 돌연변이 인지를 유추해서 확인합니다. 뿐만 아니라 세포의 대립유전자가 동형인지 이형인지 여부도 확인할 수 있습니다. 대부분의 암 샘플은 암세포와 주변 정상세포로 이루어져 있기 때문에 이런 방식의 분석이 가능합니다.

유전된 생식세포 돌연변이의 경우 이 유전자 돌연변이는 몸의 전체 세포에서 나타납니다. 정상세포에서도 암세포에서도 나타납니다. 대립유전자가 동형일 경우 이 돌연변이는 대립유전자 양쪽에서 다 나타나고 이형일 경우 한군데에서만 나타납니다. 대립유전자 동형에서 돌연변이가 나타나는 생식세포 돌연변이의 경우 VAF는 100%이고 대립유전자 이형에서 돌연변이가 나타나는 생식세포 돌연변이의 경우 VAF는 50%입니다. 다시 말하면 유전자 조각을 나열해서 비교해 보았을 때 reference sequence와 비교해서 100% 돌연변이가 생겨있으면 동형 생식유전 돌연변이 이고 50% 돌연변이가 있으면 이형 생식세포 돌연변이인 것입니다.

체성 돌연변이는 부모로부터 받은 돌연변이가 아니라 살면서 생긴 돌연변이이기 때문에 정상세포에서는 나타나지 않고 암세포에서만 나타납니다. 이 경우 VAF는 암 샘플의 순도와 조직의 다양성에 의해서 결정됩니다. 왜냐하면 암 샘플 중 암세포부분을 제외한 나머지는 정상조직이거나 암 미세환경에 있는 면역세포와 같은 것이기 때문에 이것들을 고려해서 VAF를 살펴보아야 합니다. 병리학자들이 만약 25%의 순도를 가진 조직이라고 샘플을 추정했다면 이것은 그 조직의 25%가 암 세포이고 나머지 75%는 정상세포라는 것입니다.

만약 체성 돌연변이가 대립유전자에 동형으로 나타난다면 (양쪽이 다 돌연변이) VAF는 암의 순도와 거의 일치합니다. 만약 체성 돌연변이가 대립유전자에 이형으로 나타난다면 (한쪽만 돌연변이) VAF는 암의 순도에 반정도를 차지 합니다.

하지만 많은 경우 VAF를 통해 유추하는 것이 어렵습니다. 유전자의 한부분이 증폭되어 있는 돌연변이를 포함한 경우 VAF는 증가 합니다. 만약 100%의 순도로 암샘플이 채취되었을 경우 체성돌연변이인지 생식세포 돌연변이인지 확인하기 어렵습니다. 암 샘플이 일부 돌연변이만 포함하는 경우도 생각해 보아야 합니다. 만약 VAF가 암의 순도 보다 크다면 생식세포 돌연변이일 확률이 높습니다. 반대로 VAF가 아주 낮다면 이것은 암세포의 일부 조각에만 포함된 돌연변이일 수 있습니다.

유전자 돌연변이 분류와 해석
유전자 염기서열 분석을 통해 유전자 돌연변이를 발견했다고 해서 모두 암을 일으키는 것은 아닙니다. 일부는 passenger mutation으로 암세포의 생성에 직접적인 영향을 주지 않습니다. 따라서 돌연변이에 대한 리스트를 만들어서 확인하는 것이 중요합니다. 유전자 돌연변이를 3가지로 나누어서 구분할 수 있습니다. 암에 직접적인 영향을 주는 병적인 돌연변이, 무해한 돌연변이, 알려지지 않은 돌연변이로 구분할 수 있습니다. 병적인 돌연변이의 경우 다른 암 환자들을 통해서 알려진 지식으로 구분할 수 있습니다. 예를 들면 흑색종을 일으키는 B-raf 유전자 돌연변이를 생각할 수 있습니다. 이 유전자 돌연변이를 표시하는 방식이 있는데 B-raf를 예를 들어보겠습니다.

BRAF c.1799 T>A (V600E)
BRAF는 유전자 이름이고 c.는 코딩부분 1799는 유전자안의 위치를 표시합니다. T>A는 염기가 T에서 A로 돌연변이 되었음을 의미합니다. c.1799 T>A는 DNA의 변이를 나타내는 것이고 V600E는 BRAF가 발현하는 단백질의 변이를 나타냅니다. 600의 경우는 아미노산의 위치이고 그 위치에서 아미노산이 V에서 E로 변이됨을 나타냅니다.

무해한 돌연변이는 일반적으로 발견되는 돌연변이입니다. (건강한 사람에게도) 이 경우는 driver mutation이 아님을 확인하고 암 치료의 타겟이 되는 유전자 돌연변이에서 제외됩니다. 알려지지 않은 돌연변이는 암과 관련이 있는지 알아보기 위해서 그 유전자의 기능을 확인하는데 암과 연관된 세포내 경로에서 어떤 역할을 하는지 그 경로내의 단백질에 어떻게 영향을 미치는지를 확인해야 합니다. 그리고 일반인구와 암환자 인구에서 이 돌연변이가 얼마나 차이나는 빈도로 발생하는지 확인해서 알려지지 않은 돌연변이가 암을 일으키는지 여부를 확인할 수 있습니다. 또한 이 돌연변이가 체세포 돌연변이인지 생식세포 돌연변이인지 확인하는 방법과 암의 초기에 나타나는지 말기에 나타나는지 확인하는 방법도 이 돌연변이가 암과 연관되어있는지 알아보기 위해 사용할 수 있습니다. 이런 분석은 암환자의 돌연변이 샘플이 많이 쌓일수록 암과 관련된 더욱 정확한 정보를 알 수 있습니다.

암 유전자 돌연변이의 특징을 통한 암세포 돌연변이 정도 확인과 치료방향 결정
유전자 염기 서열의 분석을 통해서 암 유전자 돌연변이를 살펴보면 암의 기원과 치료등에 유용한 정보들을 얻을 수 있습니다.

1) TMB(tumor mutational burden)
높은 TMB는 전체 유전자안에서 돌연변이가 많이 발생했음을 의미합니다. 암의 종류에 따라 TMB는 차이가 납니다. 따라서 같은 암을 가지고 있는 다른 환자와 TMB를 비교하는 것도 중요합니다.

2) 환경적인 요인 확인
유전자 염기서열의 돌연변이를 확인함으로써 환경적인 요인에 의한 돌연변이를 찾아낼 수 있습니다. 흡연자의 경우 C-G로 연결된 유전자 염기 서열이 A-T로 변화됨을 확인 할 수 있습니다. 담배 안에 들어있는 특정한 암 유발 물질이 C를 A로 변화시켜 이런 돌연변이를 만들어 냅니다. 특정한 부분에서 특정한 종류의 돌연변이가 일어났는지를 확인함으로서 암을 일으키는 환경적인 요인을 찾아볼 수 있습니다.

3) 잘못된 DNA를 고치는 기능에서의 결함
DNA가 복제되는 과정에서 잘못된 염기가 붙거나 반복되거나 빠지거나 하면 이것을 고치는 기능이 있는데 그 기능에 결함을 주는 돌연변이가 발생하면 DNA돌연변이가 많이 발생하게 됩니다. mismatch repair deficiency의 경우(MMR-D) 잘못된 염기서열을 고치는 기능에 문제가 생겨 DNA내에 잘못된 염기가 계속 존재하게 됩니다. 이 기능에 문제가 생기면 반복서열불안정성 [microsatellite instability]가 나타나 DNA 두 가닥이 딱 맞지 않고 한쪽이 더 길어져 루프가 생기게 됩니다. 이것을 통해 MMR-D를 확인할 수 있습니다. 또한 이 유전자가 발현되면서 문제가 생긴 단백질이 향후 세포 표면에 MHC분자와 함께 나타나게 됩니다. T세포가 이런 문제 있는 단백질을 발견하는데 이 세포는 이런 돌연변이 단백질을 표면에 많이 드러내게 되어 T세포가 빨리 발견하고 제거할 수 있습니다. 이런 돌연변이를 가진 환자들은 암 면역을 이용한 치료를 할 수 있는 환자 군입니다.